在過去的十幾年里，許多生物制藥公司已經(jīng)轉(zhuǎn)向使用基于聚合物的一次性生物工藝材料來開發(fā)生物產(chǎn)品，包括生物反應(yīng)器袋、容器、管路、接頭以及其他生產(chǎn)設(shè)備。特別是一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)，由于其靈活性等多方面的優(yōu)勢，在生物制藥生產(chǎn)中的應(yīng)用穩(wěn)步增加。盡管這些系統(tǒng)提高了生產(chǎn)效率，但它們的使用也存在挑戰(zhàn)和監(jiān)管問題，這其中就包括可提取物/可析出物的風(fēng)險(xiǎn)，這會影響生物制品的總體產(chǎn)量和純度。

可提取物是在比塑料和系統(tǒng)簡單接觸更惡劣的條件下，從塑料中提取出來的物質(zhì)。而可析出物是因塑料和系統(tǒng)之間相對溫和的相互作用而進(jìn)入產(chǎn)物液流中的物質(zhì)。這些物質(zhì)可能以工藝污染物、雜質(zhì)或反應(yīng)副產(chǎn)物的形式存在。可提取物/可析出物和產(chǎn)物成分之間的相互作用已被證明可能改變生物制品的物理化學(xué)性質(zhì)，從而對最終產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，在生物工藝材料研究中識別和量化這些可提取物/可析出物是很重要的，以確保最佳的細(xì)胞生長和產(chǎn)品質(zhì)量，并維持患者的安全。

重金屬是最重要的可提取和可析出物之一，可導(dǎo)致目標(biāo)生物制品的物理化學(xué)變化。有毒金屬可影響細(xì)胞生長、活力和產(chǎn)物的產(chǎn)出。仔細(xì)監(jiān)測和控制金屬物質(zhì)水平在生物工藝過程中至關(guān)重要。本文將簡要介紹在生物工藝中可能存在的重金屬可提取和可析出物及其影響。

鈷

鈷是一種可提取/可析出的金屬，潛在地存在于生物工藝過程中所使用的一次性袋子中，被認(rèn)為是一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)因素。鈷在生物工藝過程中可能導(dǎo)致多種危險(xiǎn)因素，特別是它對CHO細(xì)胞中半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響及其對IgG表達(dá)的影響，且因其濃度變化而對細(xì)胞生長的影響有所不同，從而導(dǎo)致對生物制品的不同影響。如有研究測量了細(xì)胞生長必需的輔助因子錳和濃度在0– 1 mM之間的鈷的影響，證實(shí)鈷對半乳糖轉(zhuǎn)移酶的影響是劑量依賴性的，隨著鈷濃度的增加，酶活性降低，這是由于酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被錳和鈷占據(jù)，且與錳相比，鈷的結(jié)合導(dǎo)致了較低的活化。

同時(shí)，研究還評估了鈷對重組CHO 細(xì)胞中 IgG 表達(dá)的影響，以了解其對糖基化的影響。采用不同的鈷濃度，結(jié)果顯示，3 天后，300 μM 的濃度會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，從 200 μM 濃度開始，IgG 滴度降低了 50%。在 50 μM 或更低的濃度下，未觀察到對細(xì)胞生長的影響。盡管濃度在 1-100 μM 之間的鈷會增加 CHO 細(xì)胞中的半乳糖基化水平，但添加錳可以稍微逆轉(zhuǎn)并改善這種半乳糖基化效果。 鈷還會導(dǎo)致 ROS 生成增加，其本身會通過降低溶氧水平刺激缺氧介導(dǎo)的反應(yīng)。此外，50 μM 的鈷導(dǎo)致 G1F 聚糖增加 3%，而 200 μM 的非半乳糖基化 (G0F) 增加 5%。還注意到，在 200 μM 鈷存在時(shí)，乳酸產(chǎn)量有所增加。 

鎳

鎳也被認(rèn)為是一種微量金屬，會在生物工藝過程中對CHO 細(xì)胞產(chǎn)生毒性。糖基化是一種重要的翻譯后修飾，會影響 CHO 細(xì)胞中的糖蛋白。它有助于提高生物制品的質(zhì)量，并需要在整個(gè)生物工藝過程中進(jìn)行監(jiān)測和分析。鎳會從生物工藝中使用的不同設(shè)備中析出，析出程度受溶液 pH 值、濃度、鹽含量和溫度的影響。

研究分析了鎳對 CHO 細(xì)胞的影響，顯示鎳會抑制果糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，鎳影響ROS的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激并減少半乳糖基化。繼而使重組 IgG 糖基化顯著減少。研究還測試了鎳對細(xì)胞生長和活力的影響。在高達(dá) 50 μM 的鎳存在下，生長或活力沒有變化。高于 200 μM 時(shí)，細(xì)胞生長顯著降低，而活力保持 > 60%，直到鎳濃度達(dá)到 1 mM。當(dāng)鎳濃度達(dá)到 200 μM 時(shí)，乳酸產(chǎn)量增加。當(dāng)鎳濃度 > 1 mM 時(shí)，還觀察到 IgG 糖基化從 32% 減少到 25%。

研究還評估了鎳對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。如前所述，錳是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的重要輔助因子，因此，添加不同濃度的錳和鎳以確定這是否會逆轉(zhuǎn)糖基化降低。盡管添加錳增加了糖基化，但不足以完全抑制降低。

鎳被評估為生物工藝過程中的主要析出物之一，需確定其對蛋白質(zhì)聚集和沉淀的影響。來自不同設(shè)備的極少量鎳會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。這種沉淀可以通過鎳和蛋白質(zhì)單體之間可能的螯合來解釋。此外，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有評估的賦形劑中都發(fā)現(xiàn)了痕量的鎳。

銅

雖然銅被認(rèn)為是多種代謝途徑中的基本元素，但由于產(chǎn)生ROS，高濃度銅可能具有毒性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。因此，生物工藝設(shè)備的銅析出可以破壞最佳平衡、誘導(dǎo)毒性、并阻止細(xì)胞生長。有研究分析了在不產(chǎn)生毒性的情況下，生長培養(yǎng)基中銅的最大含量。使用不同水平的銅對CHO細(xì)胞處理超過14天。獲得正常細(xì)胞生長而沒有任何毒性的銅的最小閾值在每壓實(shí)細(xì)胞體積30-60 nM之間。用高水平的銅處理CHO細(xì)胞會通過增加IgG產(chǎn)物的修飾而對生物制品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。研究還表明，CHO細(xì)胞需要最低水平的銅才能存活并實(shí)現(xiàn)最佳性能。已知C端脯氨酸酰胺化是由肽基甘氨酸羥化單加氧酶催化的，該酶需要與銅結(jié)合才能被激活。較高的銅濃度增加了該反應(yīng)，導(dǎo)致更多的IgG產(chǎn)生。但銅水平超過 50 μM 會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集增加，從而進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)質(zhì)量下降。

有實(shí)驗(yàn)證明，與銅水平較低的處理組相比，對照組的細(xì)胞活力更高，推測這是由于銅含量高而在細(xì)胞內(nèi)積累較慢。同時(shí)，他們還得出結(jié)論，0-100 μM 范圍內(nèi)的銅水平不會影響細(xì)胞生長。另有研究顯示，銅會在 CHO 細(xì)胞中引起生物蓄積行為，從而中斷細(xì)胞生長。這種蓄積現(xiàn)象可以通過銅對谷胱甘肽-氧化還原平衡的影響得到進(jìn)一步解釋，眾所周知，谷胱甘肽是抵抗毒性的重要保護(hù)劑。這種不平衡會導(dǎo)致細(xì)胞生長中斷。有人建議，壓實(shí)細(xì)胞體積中的銅濃度應(yīng)大于 30 nM 才能獲得所需的益處，同時(shí)保持低于 60 nM，以避免銅毒性。

總 結(jié)

生物制藥生產(chǎn)已經(jīng)開始廣泛使用一次性生物工藝系統(tǒng)，這種向一次性塑料系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變需要對可提取物和析出物進(jìn)行監(jiān)管和監(jiān)測，以確保患者安全。盡管最終藥品中可提取物和析出物的濃度較低，但它們能夠影響產(chǎn)品質(zhì)量，并存在隨后增加進(jìn)入患者體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。對最常見的可提取物和析出物的安全閾值進(jìn)行評估，可以確保生物生產(chǎn)過程中的細(xì)胞活力。例如，鈷、鎳和銅分別> 200 μM、>200 μM 和 >60 nM。鈷和鎳都會導(dǎo)致缺氧介導(dǎo)的反應(yīng)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。保持這些有毒金屬的安全濃度對于避免對細(xì)胞生長、活力和產(chǎn)物生產(chǎn)產(chǎn)生任何負(fù)面影響至關(guān)重要。同樣，為了確保高質(zhì)量產(chǎn)品的生產(chǎn)和患者安全，有效監(jiān)測這些有害可提取物和析出物的濃度至關(guān)重要。

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DuoBioX? Pro 一次性生物反應(yīng)器及細(xì)胞培養(yǎng)袋

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DuoWave?波浪式一次性生物反應(yīng)器及細(xì)胞培養(yǎng)袋

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