大腸桿菌是使用時間最長、應(yīng)用最廣泛的重組藥物蛋白表達宿主之一。迄今為止，超過25% 的重組生物藥物是在大腸桿菌中生產(chǎn)的。其眾所周知的遺傳特性、對其生理學(xué)的深入了解和大量表達載體工具箱的可用性，以及其低培養(yǎng)成本、短培養(yǎng)時間和產(chǎn)生大量重組蛋白的能力，使其成為一種有吸引力的宿主生物，可用于基礎(chǔ)研究和工業(yè)生產(chǎn)。

大腸桿菌中重組蛋白過度表達后，通常會出現(xiàn)包涵體(IB) 。雖然以包涵體形式而非可溶性蛋白質(zhì)形式生產(chǎn)重組生物制藥具有諸多優(yōu)點，例如產(chǎn)物產(chǎn)量高（每升培養(yǎng)液可產(chǎn)出超過 20 g的包涵體）、產(chǎn)物純度高（總蛋白質(zhì)含量高達 95％）、包涵體具有較高的機械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性、降低對蛋白水解的敏感性、以及與宿主細(xì)胞蛋白相比，大小和密度存在差異，因此易于分離包涵體。但對于包涵體，需要進行復(fù)性（重折疊）才能生成天然蛋白，然后進一步純化，以獲得純化且有活性的生物制品。盡管多年來，在細(xì)菌包涵體的溫和變/復(fù)性方法開發(fā)方面取得了很大的進展，但在工業(yè)規(guī)模條件下實施此類策略仍需要針對多方面因素的進行深入的考慮。本文旨在簡要介紹工業(yè)規(guī)模包涵體復(fù)性工藝的開發(fā)路徑。

新產(chǎn)品工藝開發(fā)的開始類似于黑匣子，通常只知道蛋白質(zhì)的序列，并且研究數(shù)據(jù)表明目的產(chǎn)物具有治療作用。為生產(chǎn)用于臨床前研究的材料而開發(fā)的純化工藝通常在小體積中進行。因此，早期工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品量太少，無法滿足市場需求。因此，有必要進一步工藝優(yōu)化和放大。時間和成本是工業(yè)化工藝開發(fā)的關(guān)鍵因素。通常使用平臺工藝、規(guī)?？s小模型和基于計算機的建模方法來確保快速的開發(fā)時間線。工藝開發(fā)的總體目標(biāo)是設(shè)計穩(wěn)健且可靠的生產(chǎn)工藝。

初步篩選和優(yōu)化復(fù)性緩沖液

為了實現(xiàn)包涵體溶解和復(fù)性，通常需要對緩沖液條件進行初步篩選。實際上，這些條件必須根據(jù)每個目的產(chǎn)物的經(jīng)驗來確定，這個過程可能非常耗時且費力。因此，該領(lǐng)域的研究已轉(zhuǎn)向使用高通量開發(fā)方法來簡化該過程。

通常在工藝開發(fā)過程中，采用實驗設(shè)計（DOE）方法，以自動化方式篩選緩沖液條件，總體積較?。?lt;2 mL），目的是在合理的工藝持續(xù)時間內(nèi)（<12 小時）獲得高產(chǎn)量和高復(fù)性濃度。此外，它還旨在限制緩沖液中的成分?jǐn)?shù)量，以實現(xiàn)較小的經(jīng)濟和生態(tài)影響。如果產(chǎn)量較低，例如，產(chǎn)量低于 50% 或折疊條件下目的產(chǎn)物的最終濃度低于 0.5 g/L，則通常會修改緩沖液條件。因此，復(fù)性緩沖液的組成很難預(yù)測，必須針對每種目的產(chǎn)物重新建立，以促進其天然構(gòu)象。使用 DOE 方法可以提高難復(fù)性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，例如使用固有熒光、 zeta 電位和 RP-HPLC等分析工具確定模式抗體片段的重折疊動力學(xué)，根據(jù)初始 DOE 的結(jié)果，進行優(yōu)化 DOE，對局部化學(xué)微環(huán)境，如稀釋因子、氧化還原對和pH 值，的細(xì)微調(diào)整導(dǎo)致測試抗體片段的重折疊效率大幅提高。

工藝設(shè)計

篩選出最佳溶解/復(fù)性緩沖液后，在臺式設(shè)備中進一步測試緩沖液組合并進行優(yōu)化。通常，工藝開發(fā)是按順序進行的。一個工藝步驟（如溶解）的最佳條件作為下一步（如復(fù)性）的輸入，后者又為下一步（如捕獲層析）提供輸入。然而，這種方法沒有考慮到遠距離工藝步驟之間的相互依賴性?？梢岳眉蛇^程模型和機器學(xué)習(xí)技術(shù)來規(guī)避這個問題，即使用過程建模和高通量方法來整合溶解、復(fù)性和捕獲層析，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，可獲得更高的收率。此外，可以使用 DOE 方式在并行的臺式反應(yīng)器中篩選對更大規(guī)模操作至關(guān)重要的工藝參數(shù)，并進行統(tǒng)計評估。從這些實驗數(shù)據(jù)中，可以確定穩(wěn)健的復(fù)性條件和動力學(xué)。

一般來說，蛋白質(zhì)復(fù)性性能通常受到許多因素的影響。這些因素包括 pH 值、溫度、緩沖液組成、氧化還原系統(tǒng)或二價離子和添加劑的存在。但反應(yīng)物的性質(zhì)或目的產(chǎn)物的固有特征也會影響復(fù)性性能。已知蛋白質(zhì)序列會影響復(fù)性性能，但由于時間和資源有限，這種影響如何發(fā)生通常無法在工藝開發(fā)的背景下完全解答，蛋白質(zhì)中配對半胱氨酸的存在可以作為可能的工藝開發(fā)路線的指標(biāo)。此外，蛋白質(zhì)的疏水性模式和機器學(xué)習(xí)方法的結(jié)合也有助于提供支持性信息。

此外，可以考慮影響可制造性的進一步影響，例如攪拌器速度、工藝持續(xù)時間、容器尺寸和幾何形狀，甚至選擇的復(fù)性方法，如批次、補料分批或反向稀釋。在實施基于風(fēng)險的方法之前，應(yīng)評估可能影響復(fù)性過程的因素。

顯示了機械和化學(xué)工藝參數(shù)對蛋白質(zhì)復(fù)性過程影響的魚骨圖

在工業(yè)環(huán)境中，復(fù)性應(yīng)在高蛋白質(zhì)濃度下進行。然而，蛋白質(zhì)濃度的增加會促進聚集并降低總產(chǎn)量。已知復(fù)性過程會與聚集過程競爭，因此降低變性蛋白質(zhì)的注入速率并確保蛋白質(zhì)/復(fù)性緩沖液界面的湍流狀態(tài)應(yīng)能減少聚集體的形成。溶解蛋白質(zhì)與復(fù)性緩沖液可以通過多種方法混合。包括批次、補料分批和反向稀釋。在批次復(fù)性中，溶解的蛋白質(zhì)一次性加入到復(fù)性緩沖液中。這種方法通常用于工藝開發(fā)過程中的第一次實驗，但在后期開發(fā)中需要改進，以減少剪切力，并允許使用生產(chǎn)規(guī)模的泵送設(shè)備進行處理。在補料分批方法中，溶解的蛋白質(zhì)以脈沖方式或在較長時間內(nèi)連續(xù)添加，這可提高工藝生產(chǎn)率（g/L/h）。反向稀釋也用于工業(yè)規(guī)模，其中，復(fù)性緩沖液被稀釋到罐內(nèi)已經(jīng)存在的溶解蛋白質(zhì)中，這里，相對緩慢的條件變化有可能降低聚集的趨勢。

強離液條件會影響復(fù)性和聚集的速率，但聚集受到的影響更嚴(yán)重。因此，變性條件必須足夠低以促進蛋白質(zhì)的柔韌性并允許目的產(chǎn)物復(fù)性，但也必須足夠高以防止蛋白質(zhì)聚集。同時，還需要優(yōu)化的氧化還原對以確保目的產(chǎn)物正確復(fù)性。必須考慮和測試從緩沖液制備到使用氧化還原對期間的穩(wěn)定性。此外，容器頂部空間的氧氣存在會影響復(fù)性性能。

在復(fù)性領(lǐng)域，已有幾種方法被熟知并應(yīng)用于工藝放大。這些方法旨在保持諸如雷諾數(shù)(Re)、混合時間、功率輸入和 kLa (氧氣從氣相轉(zhuǎn)移到液相的速率) 在不同規(guī)模條件下保持恒定。這些參數(shù)與設(shè)備相關(guān)，需要通過初步測試（混合時間，kLa）或計算流體動力學(xué)（CFD）獲得工藝知識。不同規(guī)模條件下，容器幾何形狀（高度/直徑比）和攪拌方法的變化使得決定應(yīng)用哪種放大系數(shù)變得困難。

目的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在與否為如何進行放大提供了很好的初步線索。如果目的產(chǎn)物不含半胱氨酸，則不會形成二硫鍵來支持復(fù)性，而氧濃度或與氧化還原對的平衡將僅具有次要的重要性。然后可以考慮通過恒定功率輸入或混合時間進行放大。然而，生物治療藥物中不含有半胱氨酸的可能性很小。如果目的產(chǎn)物含有配對的半胱氨酸，則應(yīng)進行實驗以量化復(fù)性過程中的氧依賴性。由于氧依賴性也依賴于所用的氧化還原系統(tǒng)，因此應(yīng)在實驗室規(guī)模的實驗中進行。一種簡單的方法是通過在復(fù)性過程中用氧氣或氮氣疊加來置換或富集所用緩沖液中的氧氣。當(dāng)動力學(xué)或總步驟產(chǎn)量不再增加時，可獲得目的產(chǎn)物的最佳氧化還原對。如果緩沖液通氣可提高整體工藝性能，則可以修改所選的緩沖系統(tǒng)以獲得具有成本效益的工藝。

工藝溫度也會影響最終產(chǎn)量、反應(yīng)動力學(xué)和復(fù)性池的穩(wěn)定性。這些影響在很大程度上取決于目的產(chǎn)物和所用的技術(shù)?？贵w片段的復(fù)性在15-30°C 的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，盡管域間二硫鍵的形成主要取決于環(huán)境溫度。工藝溫度和溫度控制方法已經(jīng)顯示出了減少聚集的良好效果，所以溫度可以作為工藝開發(fā)中的一個校正變量。

工藝規(guī)模放大及實施

在生產(chǎn)工廠中實施已開發(fā)的復(fù)性工藝之前，通常會在更大、更具代表性的規(guī)模下進行測試，其特征性放大倍數(shù)為10 到 20。然后在轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)工廠之前確定最終設(shè)置。大部分工作應(yīng)該在早期開發(fā)階段進行，此時實驗成本較低，并且可以實現(xiàn)大多數(shù)改進工藝設(shè)計的效果。在工藝開發(fā)過程中，需要經(jīng)驗和結(jié)構(gòu)化的方法來考慮正確的因素。為了開發(fā)強大的工藝，應(yīng)遵循質(zhì)量源于設(shè)計 (QbD) 方法，這是一種整體的、科學(xué)驅(qū)動的戰(zhàn)略。

新工藝的可行性在很大程度上取決于生產(chǎn)設(shè)施的能力。當(dāng)然，在工藝開發(fā)過程中，新工藝會適應(yīng)現(xiàn)有工廠設(shè)備的限制，但在某些情況下，必須通過額外的工廠設(shè)施來克服限制，如調(diào)整進水管線、泵、可移動的中間罐等，從而實現(xiàn)穩(wěn)健的工藝布局。在實際測試或生產(chǎn)運行之前，可以在建模和模擬的支持下規(guī)劃復(fù)雜的子步驟。計算流體動力學(xué)(CFD) 研究提供了良好的設(shè)備表征。它提供了對設(shè)備中發(fā)生的混合和反應(yīng)現(xiàn)象的洞察，如對反應(yīng)動力學(xué)的局部影響、粘度和密度變化、相分離和流動曲線等。瞬態(tài)或靜態(tài)過程建模和模擬有助于早期映射和協(xié)調(diào)工藝流程布局，以確定宏觀限制，如反應(yīng)速率、緩沖液體積、膜面積、流速等。

監(jiān)測工具

盡管有各種結(jié)構(gòu)化方法，但復(fù)性仍然是一個黑匣子，開發(fā)基于經(jīng)驗主義，并且嚴(yán)重依賴離線數(shù)據(jù)，尤其是在工業(yè)環(huán)境中。在線測量、監(jiān)控、建模和控制此工藝步驟對于避免工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)不必要的偏差非常重要。過程分析技術(shù)(PAT)是通過測量關(guān)鍵工藝參數(shù) (CPP) 來分析和控制生產(chǎn)過程的工具。關(guān)鍵過程參數(shù)（CPP） 是在工藝開發(fā)過程中已證實會影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的工藝參數(shù)。應(yīng)以瞬態(tài)方式監(jiān)控預(yù)定義的 CPP，從而提高數(shù)據(jù)一致性并最大限度地減少批次失敗。

PAT的實施通常使用兩種方法：軟傳感器，即基于在線可測量數(shù)據(jù)，如氧化還原、溶氧、pH；以及光譜方法，通常在線、近線或旁路應(yīng)用。過去幾十年來，光譜工具因其快速的測量時間和可能的在線/入線實施策略而成為有前途的過程監(jiān)控工具。此外，這些基于光譜的儀器被證明能夠識別蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的變化，這是確保生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所必需的知識，如使用差示掃描熒光法，可快速區(qū)分未折疊、錯誤折疊和折疊狀態(tài)，或者實施各種分析工具來揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能之間相互作用的潛力。然而，這些技術(shù)尚未實現(xiàn)針對不同蛋白質(zhì)形式和高復(fù)雜性緩沖液的普遍應(yīng)用，未來的主要關(guān)注點應(yīng)放在 PAT 技術(shù)的更廣泛適用性上，并考慮最常用的緩沖條件。

鑒于潛在重組產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)差異性很大，預(yù)計對復(fù)性策略優(yōu)化的需求將持續(xù)甚至增長。同時，自動化和高通量方法的不斷改進將有助于克服經(jīng)驗障礙。結(jié)合強大的分子建模和數(shù)據(jù)管理工具，這將從本質(zhì)上節(jié)省資源，縮短工藝開發(fā)時間，并總體上促進更穩(wěn)健、更高效的生產(chǎn)工藝。

多寧生物為基于微生物宿主系統(tǒng)的重組蛋白生物藥生產(chǎn)提供一站式解決方案，并特別關(guān)注關(guān)鍵工藝節(jié)點，包括上游微生物發(fā)酵、宿主細(xì)胞破碎/蛋白提取、層析純化以及超濾濃縮/換液，且所有工藝系統(tǒng)和耗材可滿足從實驗室規(guī)模到工業(yè)化規(guī)模的放大要求，并確保不同階段之間的無縫過渡。多寧生物高質(zhì)量且穩(wěn)定的產(chǎn)品/技術(shù)，供應(yīng)結(jié)合眾多相關(guān)行業(yè)應(yīng)用經(jīng)驗，可準(zhǔn)確且完善地支持您的每一個需求。

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DuoMix?臺式攪拌系統(tǒng)

多寧自主研發(fā)2L-20L DuoMix?臺式攪拌系統(tǒng)，50L-3000L DuoMix?落地攪拌系統(tǒng)及配套3D配液攪拌袋等產(chǎn)品實現(xiàn)提供一站式配液整體解決方案，適合工藝開發(fā)及大規(guī)模生產(chǎn)等不同應(yīng)用場景。其中，DuoMix?落地磁力攪拌系統(tǒng)由控制柜、罐體、驅(qū)動電機組成。其中控制柜懸掛于罐體上，為一體式設(shè)計，驅(qū)動電機及磁頭置于罐體底部，腳輪上方為稱重模塊。設(shè)備可適配市面常見槳葉，可配套pH及電導(dǎo)率傳感器，溫度傳感器，溫度控制單元及蠕動泵等可選模塊使用。同時，外觀尺寸及形狀可高度個性化定制，滿足不同工藝及流程需求。DuoMix?臺式及落地磁力攪拌系統(tǒng)軟件操作界面為用戶友好型，支持至少三級權(quán)限、配方編輯、報警功能、傳感器校準(zhǔn)功能、數(shù)據(jù)記錄與導(dǎo)出、審計追蹤等功能。

此外，為幫助用戶攪拌/混合工藝開發(fā)和規(guī)模放大，我們針對不同容器尺寸、幾何結(jié)構(gòu)、攪拌槳設(shè)計等配置的系統(tǒng)提供完整的計算流體力學(xué)報告，包括速度場、混合性能、攪拌功率、壓力、尾渦結(jié)構(gòu)、剪切、氣液分布等參數(shù)的分析，詳細(xì)報告，可以我們的產(chǎn)品和技術(shù)團隊聯(lián)系獲取。

計算流體動力學(xué)報告結(jié)果示例

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