摘 要

多寧DuoBioX^TM 提供從研究型到生產(chǎn)型細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，Explore系列臺式生物反應(yīng)器定位于實驗室階段的上游工藝開發(fā)、優(yōu)化和PC研究，規(guī)格從500 mL-15 L；Pro系列一次性生物反應(yīng)器是符合GMP商業(yè)化要求的生產(chǎn)型設(shè)備，規(guī)模從50-2,000 L。

Explore系列是采用了衛(wèi)星罐分布式布局的臺式玻璃生物反應(yīng)器，具有完全控制功能，能夠支持0.6-15 L培養(yǎng)規(guī)模。軟件采用了先進的SCADA架構(gòu)，能夠?qū)崿F(xiàn)平行多聯(lián)培養(yǎng)，數(shù)據(jù)采集和結(jié)果對比分析。

Explore系列平行生物反應(yīng)器

Pro系列一次性生物反應(yīng)器采用底部攪拌式罐體設(shè)計，可實現(xiàn)從50 L-2,000 L規(guī)模生物工藝的連續(xù)放大，結(jié)合多寧完全自主研發(fā)制造的3D一次性細胞培養(yǎng)袋，具有良好的生物相容性優(yōu)點，其靈活的管路設(shè)計，滿足各類復(fù)雜的上游工藝過程；Pro的攪拌通氣一體設(shè)計，不僅能提供良好的混勻效果同時又保證了優(yōu)異的氣體傳質(zhì)性能。

Pro系列一次性生物反應(yīng)器

細胞培養(yǎng)工藝放大一致性-對于工藝開發(fā)階段的臺式生物反應(yīng)器來說，能夠為后續(xù)的放大提供可靠的過程參數(shù)作為放大依據(jù)尤為重要，所以通常采用3 L-5 L生物反應(yīng)器作為建立反應(yīng)器工藝的開發(fā)起點以及持續(xù)優(yōu)化的工具。本試驗采用恒定單位體積功耗比（P/V）一致的基本放大原則，對Explore臺式3 L規(guī)模至Pro 500 L規(guī)模的培養(yǎng)工藝一致性進行考察，證明兩者之間的具有良好的放大一致性表現(xiàn)。

CHO 細 胞

本試驗所采用的細胞株為重組CHO-K1細胞，該細胞表達的產(chǎn)物為一種雙特異性抗體。CHO細胞，即中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary）,它是基因工程蛋白研究中最具有代表性的哺乳動物表達載體，是用來表達外源蛋白最多也是最成功的一類細胞。CHO細胞能夠在無血清懸浮培養(yǎng)中以高密度生長，并且在延長的發(fā)酵周期中維持高水平的蛋白質(zhì)表達。

超過70%的蛋白質(zhì)藥物，如單克隆抗體、重組蛋白、疫苗等的首選制造細胞都是CHO細胞。目前我們常用的CHO細胞系有：CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-S、CHO-DG44、CHO-GS等。

方 法 與 材 料

培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Media C（包括種子培養(yǎng)）

補料培養(yǎng)基：DN feed 2，DN feed B2

細胞株

CHO-K1

生物反應(yīng)器系統(tǒng)

DuoBioX^TM Explore系列平行生物反應(yīng)器 規(guī)格3 L

DuoBioX^TM Pro系列一次性生物反應(yīng)器 規(guī)格200 L，500 L

操作方式

批次流加（Fed Batch），初始培養(yǎng)體積一般小于罐體最大工作體積，留出的空間將在后續(xù)的培養(yǎng)過程中進行多次間歇性補料，所以培養(yǎng)體積會逐漸增加直至培養(yǎng)結(jié)束。細胞接種后會消耗初始培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分（如碳源、氮源）用于生長。隨著細胞密度不斷增加，罐內(nèi)營養(yǎng)成分會越來越少，同時代謝副產(chǎn)物不斷累積，通過補料可以及時補充細胞所需的營養(yǎng)成分，使細胞密度進一步增加，當(dāng)代謝副產(chǎn)物累積至細胞生長受到影響，細胞密度和活率也會從高峰開始呈下降趨勢。

pH控制

酸調(diào)節(jié)采用向培養(yǎng)體系中1 mm鼓泡通入CO₂氣體下調(diào)pH值。

堿調(diào)節(jié)通過蠕動泵向罐內(nèi)泵入堿溶液如Na₂CO₃，NaHCO₃或NaOH等上調(diào)pH值。

通常情況下CHO細胞培養(yǎng)合適的pH環(huán)境范圍為7.0-7.2。本試驗中，罐內(nèi)pH值通過pH電極在線測量，根據(jù)測量值自動反饋調(diào)節(jié)CO₂ 質(zhì)量流量計流速和堿泵轉(zhuǎn)速. pH控制死區(qū)設(shè)為±0.2，可以有效防止pH調(diào)節(jié)過沖。

DO控制

通過向罐內(nèi)內(nèi)通入不同種類的氣體來實現(xiàn)培養(yǎng)體系的溶氧控制。向罐內(nèi)鼓泡通入Air和O₂的方式用來提高DO，而N₂可以用來控制DO的下調(diào)，實現(xiàn)較低的DO水平甚至無氧環(huán)境維持。因氧氣在培養(yǎng)基中的溶解度較低，其傳質(zhì)效率受底部通氣的比表面積、接觸時間影響。大多數(shù)哺乳動物細胞生長溶解氧適宜范圍通常在20%-60%之間。培養(yǎng)基的溶解氧通過光學(xué)DO電極在線監(jiān)測，根據(jù)測量值自動反饋調(diào)節(jié)MFC-O₂ 流量。

本試驗中Explore臺式生物反應(yīng)器底部Sparger的孔徑采用1 mm大泡，槳葉為經(jīng)典單層三葉式，葉片角度呈45°傾斜，在產(chǎn)生向下的軸向流同時也能降低攪拌對細胞的剪切力。Pro一次性生物反應(yīng)器培養(yǎng)初期采用1 mm大泡底部通氣，通氣策略采用大泡和微泡組合方式，當(dāng)VVM達到0.3后，可開啟20 μm底部微泡通氣Sparger作為補充。

補料控制

根據(jù)Fed Batch操作方式特點，培養(yǎng)過程中需要定時補料，所以補料控制通過Explore臺式反應(yīng)器控制器的Auxiliary模擬4-20 mA輸入接口連接外置臺秤，Pro自帶罐體稱重Load Cell，兩套系統(tǒng)通過重量控制內(nèi)置Feed In蠕動泵進行自動補料，補料時間點及頻次通過在控制軟件中編程預(yù)設(shè)，自動完成。

參數(shù)設(shè)定與控制策略-批次流加

反應(yīng)器配置表

活細胞密度和活率

細胞代謝和滲透壓

蛋白濃度

結(jié) 論

按照等P/V一致的放大基本原則，對CHO-K1細胞Fed Batch培養(yǎng)工藝順利實現(xiàn)從3 L臺式反應(yīng)器至200 L和500 L規(guī)模一次性生物反應(yīng)器的工藝放大，細胞生長表現(xiàn)及蛋白產(chǎn)量(>4 g/L) 具有良好一致性表現(xiàn)。

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培養(yǎng)基產(chǎn)品信息

生物反應(yīng)器產(chǎn)品信息

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