糖尿病是一種全球性疾病，有超過 4.2 億人（世界人口的 6%）患有糖尿病，預計到 2030 年這一數(shù)字將激增至 5 億，到 2045 年將激增至 7 億。全世界糖尿病患者人數(shù)的增加將導致對胰島素的需求隨之增加。此外，對負擔得起的胰島素的需求未得到滿足，尤其是在低收入和中等收入國家。許多完全依賴胰島素生存的 1 型糖尿病患者無法獲得胰島素。對于需要胰島素治療的 6000 萬 2 型糖尿病患者，其中有二分之一的人由于價格問題而沒有獲得胰島素（WHO 2021）。

注射胰島素對于治療 1 型和 2 型糖尿病都很重要，重組人胰島素已被證明比提取的胰島素具有顯著優(yōu)勢。對于胰島素的生產(chǎn)，報道有兩種不同的生產(chǎn)方法。在第一種方法中，胰島素的 A 鏈和 B 鏈作為包涵體分別在細菌中培養(yǎng)。然后，對兩條鏈進行單獨純化，然后進行化學結合，之后進行最終的純化步驟。在第二種技術中，胰島素原在大腸桿菌中的表達采用色氨酸啟動子的形式，以蛋氨酸與胰島素原相連。溴化氰 (CNBr) 用于切割連接，然后通過正確的二硫鍵形成折疊肽，并最終通過酶促作用消除 C 肽。優(yōu)選采用“胰島素原路線”，因為它只需要單一的發(fā)酵和純化程序，與雙鏈組合方法相比，生產(chǎn)過程更加高效。

除了使用細菌作為宿主系統(tǒng)外，酵母也被用于胰島素的商業(yè)生產(chǎn)。商業(yè)上使用的主要酵母菌株是釀酒酵母和畢赤酵母。基于酵母的表達系統(tǒng)產(chǎn)生分泌到培養(yǎng)物上清液中的可溶性胰島素前體。使用細菌和酵母作為表達系統(tǒng)各有利弊。通過細菌包涵體途徑生產(chǎn)前體胰島素通常會產(chǎn)生更高的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)率。與生物活性治療性蛋白的可溶性表達相比，包涵體具有良好的機械穩(wěn)定性并且能夠抵抗蛋白水解降解。在下游純化方面，與需要從培養(yǎng)上清液中去除大量宿主細胞蛋白雜質(zhì)的分泌蛋白相比，包涵體中的目標蛋白也以更純和更濃縮的狀態(tài)分離。與宿主蛋白相比，由于包涵體的大小和密度不同，因此從包涵體中分離肽也更容易。

使用大腸桿菌作為大規(guī)模重組胰島素生產(chǎn)的表達系統(tǒng)具有生長速度高、培養(yǎng)基要求簡單、易于操作、產(chǎn)量高和成本效益高的優(yōu)點。大腸桿菌也有很好的遺傳學特征，并且有大量的突變宿主菌株和克隆載體可供使用。然而，大腸桿菌的包涵體生產(chǎn)途徑需要復雜的處理，例如溶解和重折疊程序，以獲得功能齊全的多肽。對于大多數(shù)生物制藥公司而言，大腸桿菌仍然是生產(chǎn)重組胰島素的首選宿主系統(tǒng)，在大多數(shù)情況下，人胰島素及其類似物在包涵體中表達。胰島素類似物是合成產(chǎn)生的胰島素變體，其氨基酸序列與天然人胰島素不同。已經(jīng)進行了此類改變以更接近地模擬人體中胰島素分泌的正常生理模式。

處在大腸桿菌包涵體中的單鏈胰島素前體分子大多被錯誤折疊。從細胞中提取包涵體，洗滌，然后溶解前體分子。胰島素原的產(chǎn)生需要肽折疊和二硫鍵的伴隨形成。酶促反應后，再折疊的前體分子通過去除 C 鏈和 N 端融合肽而轉化為異二聚體胰島素分子。需要各種層析純化步驟來去除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、細胞膜碎片和消化副產(chǎn)物，以產(chǎn)生高度純化的產(chǎn)品。

從大腸桿菌包涵體中純化重組人胰島素/類似物的下游工藝很復雜，涉及多個步驟，不同公司建立的工藝流程的細節(jié)通常是其專有的。每一步采用的方法都會對下一步的產(chǎn)品純度和收率產(chǎn)生重大影響，因此在開發(fā)和優(yōu)化方面做深入的考量和研究。