雙特異性抗體（bsAb）可以同時(shí)結(jié)合兩種不同類型的抗原或同一抗原上的兩種不同表位，其可以按多種結(jié)構(gòu)形式制備，大體可分為 IgG 樣和非 IgG 樣兩大類，前者保留了傳統(tǒng)mAb兩個(gè) Fab 臂和一個(gè) Fc 區(qū)的結(jié)構(gòu)，但兩個(gè) Fab 位點(diǎn)結(jié)合不同的抗原，其通常用 quadroma， 或雜合雜交瘤，方法制造，但這種方法依賴隨機(jī)機(jī)會(huì)形成可用的 bsAb，效率低下。另一種制備 IgG 樣 bsAb 的方法稱為“knobs into hole”（KiH），它依賴于從一個(gè) mAb 中引入重鏈中大氨基酸的突變，以及另一個(gè) mAb 重鏈中小氨基酸的突變。這使得目標(biāo)重鏈（及其相應(yīng)的輕鏈）能夠更好地結(jié)合在一起，并使 BsAb 的生產(chǎn)更加可靠。非IgG樣bsAb 完全缺乏 Fc 區(qū)，因此設(shè)計(jì)策略相對(duì)簡(jiǎn)單。這包括化學(xué)連接的 Fab，以及各種類型的二價(jià)和三價(jià)單鏈可變片段 (ScFv)，此外，還有一些可以模擬兩種抗體可變結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。其中，新的形式還包括雙特異性 T 細(xì)胞銜接器器 (BiTE)、四價(jià)反平行結(jié)構(gòu) (TandAbs) 以及僅VH 的Bi-Nanobody。多種非 IgG 樣 bsAb的共同特點(diǎn)是分子量低，因此腫瘤組織通透性高，但半衰期相對(duì)較短。

通過(guò)不同的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和作用機(jī)制，相比傳統(tǒng)抗體，bsAb的治療性優(yōu)勢(shì)包括：介導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用；雙重靶向免疫檢查點(diǎn)，發(fā)揮獨(dú)特或重疊功能，有效防止耐藥性；增強(qiáng)的特異性、靶向性和降低的脫靶毒性；有效降低治療成本，如研究顯示BiTE的治療效果可達(dá)常規(guī)抗體的100-1,000倍，劑量可低至原劑量的1/2000，從而顯著降低藥物治療成本。與聯(lián)合療法相比，bsAb的成本也遠(yuǎn)低于兩種單藥組合的成本。

大腸桿菌是表達(dá)scFv的常見(jiàn)選擇，因?yàn)榧?xì)菌可在廉價(jià)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，并且可以大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)。然而，表達(dá)的 scFv 分子可能會(huì)被錯(cuò)誤折疊或形成包涵體，需要額外的下游工藝步驟來(lái)溶解和重折疊蛋白質(zhì)。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如CHO，可以克服這些問(wèn)題，因?yàn)檎婧思?xì)胞具有先進(jìn)的內(nèi)部蛋白質(zhì)折疊過(guò)程以及進(jìn)行復(fù)雜翻譯后修飾的能力，其可穩(wěn)定地表達(dá)蛋白質(zhì)并達(dá)到足夠高的滴度，且具有良好的生產(chǎn)可放大性?；陬愃频脑?，IgG樣bsAb主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)。但對(duì)于不對(duì)稱異源二聚體結(jié)構(gòu)，需要特定的蛋白質(zhì)/細(xì)胞工程，如已報(bào)道的KiH和CrossMab技術(shù)，以促進(jìn)正確的配對(duì)，緩解游離的重鏈、輕鏈、同源二聚體、半分子和錯(cuò)配的抗體等雜質(zhì)帶來(lái)的挑戰(zhàn)，提高產(chǎn)品的可制造性。

細(xì)胞培養(yǎng)基的成分已被證明會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此應(yīng)考慮將培養(yǎng)基設(shè)計(jì)作為控制細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中部分產(chǎn)品、聚體和產(chǎn)品異構(gòu)體水平的一種手段。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)溫度的調(diào)節(jié)也被證明可控制半抗體和聚體的形成。在培養(yǎng)方式方面，研究顯示，相比傳統(tǒng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)可通過(guò)降低產(chǎn)品在生物反應(yīng)器內(nèi)的滯留時(shí)間，防止積聚以及濃度增加，降低bsAb分子的物理或化學(xué)降解，而提高bsAb的質(zhì)量和產(chǎn)量。

在下游工藝中，由于mAb和bsAb之間存在一定的結(jié)構(gòu)相似性，目前許多bsAb的純化方法都是基于常規(guī) mAb 的成熟純化工藝來(lái)開發(fā)的，如通常使用親和、電荷、尺寸、疏水和混合層析模式，并應(yīng)用其它策略來(lái)克服 bsAb 帶來(lái)的獨(dú)特挑戰(zhàn)，包括聚體、片段形成和錯(cuò)誤配對(duì)的產(chǎn)品。Protein A親和層析仍是bsAb下游工藝中最常用的親和純化方法之一。此外，在bsAb設(shè)計(jì)中，通過(guò)在一條重鏈引入點(diǎn)突變，改變Protein A結(jié)合親和性，即可通過(guò)差異Protein A親和層析，區(qū)別同源和異源二聚體，實(shí)現(xiàn)有效的分離和雜質(zhì)去除。Protein A親和層析也被證明可有效通過(guò)pH梯度洗脫從目標(biāo)產(chǎn)物中分離半抗體。同樣的策略，也被探索用于Protein G。而對(duì)于基于片段的bsAb，可選擇固定化金屬親和層析（IMAC）或能夠與CH1區(qū)域或Kappa或Lambda 鏈結(jié)合的親和配基，如Protein L親和層析。離子交換層析通常作為精純步驟，結(jié)合特定的操作條件，其也可用于去除錯(cuò)配產(chǎn)物和片段。通過(guò)組合和利用多種基本分離技術(shù)的混合模式層析顯示出了進(jìn)一步提高下游純化平臺(tái)能力的潛力，不同類型的此類填料已被證明可用于去除錯(cuò)配的產(chǎn)物、片段以及聚體。切向流過(guò)濾常用于工藝流程中的濃縮和換液目的，但也有研究顯示，通過(guò)選擇特定的孔徑，如300kD，可以很好地去除bsAb聚體。